2025年pcr检验实验室(五篇)

pcr检验实验室篇三

pcr检验实验室检查要点指南（征求意见稿）

pcr检验实验室是指通过基因扩增的方式检测特定的dna或rna的检验实验室。聚合酶链反应（pcr）是一种在体外特异性扩增靶dna序列的技术，其基本过程为模板双链dna的变性、引物与模板dna的退火和在dna 聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板，理论上，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2n倍。pcr操作简单，短时间内在体外可获得数百万个特异靶dna序列的拷贝，为临床疾病的诊断、治疗监测和预后评估提供了一种极有帮助的实验室辅助手段。

pcr检验实验室是pcr试剂的生产企业在产品检验过程中不可缺少的工作环境，其环境控制水平和质量管理水平直接影响着最终产品的是否合格，能否放行。由于该产品本身的特殊性，《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》和《医疗器械生产质量管理规范体外诊断试剂现场检查指导原则》的条款中，明确对pcr试剂的生产和检验环境做出规定。本检查指南旨在帮助北京市医疗器械监管人员增强对pcr检验相关过程的认知和把握，指导全市医疗器械监管人员对pcr检验实验室设计建设与质量控制的监督检查工作。同时，为pcr类体外诊断试剂产品生产企业在pcr检验实验室的设计建造和管理要求提供参考。

本检查指南主要以现行医疗器械和卫生行业的法规、标准以及相关文献中对于pcr检验实验室的规定为基础，尤其是以《全国临床检验规程》（第三版）的相关要求为主，部分借鉴了《医疗机构临床基因扩增管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《临床诊断中聚合酶链反应（pcr）技术的应用》（ws/t 230-2002）等行业标准的相关要求，旨在帮助北京市医疗器械监管人员增强对pcr检验实验室的认知和掌握，同时为体外诊断试剂生产企业开展pcr检验实验室管理活动提供参考。

当国家相关法规、标准、检查要求发生变化时，应当重新讨论以确保本检查指南持续符合要求。

一、适用范围

本检查指南可作为北京市食品药品监督管理局组织、实施的体外诊断试剂产品注册质量管理体系现场核查、《医疗器械生产许可证》现场核查、医疗器械生产监督检查等各项涉及pcr检验实验室检查的参考资料。

基因测序检验实验室等涉及pcr实验的相关部分应当参照本检查指南执行。

二、检查要点及流程

以下检查要点的表述主要分为对现场情况和文件资料的检查两部分，但在实际检查过程中应当特别注意现场查看、询问、记录的情况与企业的规定、文件、记录的符合性。

（一）现场查看企业pcr检验实验室布局

企业应当提供pcr实验室设计方案和/或平面设计图（应当标明风向或压差梯度）。

检验实验室与pcr产品生产区域应当在各自独立的建筑物或

空间内，保证空气不直接连通，防止扩增时形成的气溶胶造成交叉污染。

2.原则上pcr检验实验室应当设臵以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。

若使用实时荧光定量pcr仪且不需要进行后续产物分析工作，扩增区、扩增产物分析区可合并。若使用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。

3.各区域在物理空间上应当完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态。不应只是形式上的分区，不应一个区域嵌套一个区域。

4.各区域不应有空气的直接相通。扩增区与扩增产物分析区各区域宜采用独立直排方式出风。

采用空调机组方式的，pcr实验室应当具备独立空调机组；同时应当考虑停机后各房间空气连通的可能性，采取必要的控制措施。

5.按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力应当以递减的方式进行，使得pcr检验实验室的空气流向应当按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。

空气流向应当为单向，禁止下游污染上游。应当设臵合理的压差梯度，并安装压差监测装臵，以有效证明空气流向，压差梯度不宜低于5帕。

6.设臵缓冲间的，缓冲间内通向内实验室和走廊的门应当安装连锁装臵或采取相应措施，避免出现两个门同时打开的情况。

7.各区间若设臵传递窗，应当为双侧开门，要求密封严实，并且两侧的门应当为互锁装臵或采取相应措施保证两侧门不会同时开启。

（二）现场查看各区仪器设施配臵

1.试剂储存和准备区的功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。配套用品一般应当包括：

（1）2℃～8℃和-20℃以下冰箱。（2）混匀器。（3）微量加样器。（4）紫外消毒设备。

（5）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。（6）专用工作服和工作鞋(套)。（7）专用办公用品。

2.标本制备区的功能：核酸（rna、dna）提取、贮存及加样。配 套用品一般应当包括：（1）2-8℃冰箱、-20℃以下冰箱。（2）高速离心机。（3）混匀器。

（4）水浴箱或加热模块。（5）微量加样器。（6）紫外消毒设备。（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带 滤芯）。

（9）专用工作服和工作鞋(套)。（10）专用办公用品。

（11）如需处理大分子dna，应当具有超声波仪。

3.扩增区的功能：cdna合成、dna扩增及检测。配套用品一般应当包括：

（1）核酸扩增仪。（2）微量加样器。（3）紫外消毒设备。

（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高压处理的离心管和 加样器吸头（带滤芯）。（5）专用工作服和工作鞋。（6）专用办公用品。

4.扩增产物分析区的功能：扩增片段的进一步分析测定。视检验 方法不同而定，基本配臵如下：（1）微量加样器。（2）紫外消毒设备。

（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、加样器吸头（带滤芯）。（4）专用工作服和工作鞋。（5）专用办公用品。5.设备的维护保养

应当建立设备维护保养规程，计量设备应当定期检定。例如核酸扩增仪、微量加样器、生物安全柜、离心机应当每年进行检定或校准工作。

（三）检查工作流程及注意事项

1.进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

2.各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。

3.不同工作区域的工作服应当加以区分，不得混用（例如可以采用不同颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将本区域工作服带出。

4.实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具并防止交叉污染。实验垃圾属于医疗废物的应当按《医疗废物管理条例》相关规定进行处理。

5.工作结束后，应当立即对工作区进行清洁及消毒。6.贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区。

试剂盒中的阳性对照品及质控品应当保存在标本处理区。试剂应当使用分子生物学级别试剂，使用的纯化水应当高压灭菌。质检用于原辅料、半成品、成品检验用的pcr反应试剂应当有相应的质量标准及操作程序。

7.为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，应当盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，应当在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。

8.应当避免气溶胶所致的污染，尽量减少在扩增区内的走动，扩增反应管不得在扩增区打开。

9.扩增产物分析区有可能存在某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，应当注意实验人员的安全防护。

（四）检查人员培训情况

参与pcr检验工作人员应当具备相应的专业知识和技能，包括能熟练操作相关设备,明确整个工作的流程,掌握出现污染情况的处理方法以及实验室质量控制方法和检测结果的解释。

检查员可以通过询问或要求企业实际操作的方式对其进行评价，也可以通过查阅生产企业的培训记录的适宜性和完整性对其进行综合评价。

附件：理想的pcr检验实验室设计 图a 缓冲间为负压的理想pcr实验室设臵模式

图b 缓冲间为正压的理想pcr实验室设臵模式

图a和图b所给出的pcr检验实验室设臵图应是较为理想的设臵模式，推荐有能力的参照此种模式设计。

pcr检验实验室篇四

《pcr检验实验室检查要点指南》概述

北京市医疗器械技术审评中心（100061）郑婕 冯路 赵阳 王辉

摘要：目的目的 明确体外诊断试剂生产企业pcr检验实验室设置和管理相关要求，指导并规范监督管理部门开展现场检查工作。方法方法 采用收集相关文献资料、结合北京市生产企业现状、组织企业验证、经过相关专家讨论、公开征求意见后最终确定主要检查要求。结果与结论结果与结论 要点指南从实验室布局、仪器设施配置、现场及文件检查工作流程及注意事项、人员培训情况四个方面描述了现场检查重点关注的内容。关键词：pcr检验实验室；检查要点指南；工作流程；注意事项

中图分类号：r955 文献标识码：a文章编号：1005-8257（2015）11-0004-02 pcr检验实验室是指通过基因扩增的方式检测特定的dna或rna的检验实验室。聚合酶链反应（pcr）是一种在体外特异性扩增靶dna序列的技术，其基本过程为模板双链dna的变性、引物与模板dna的退火和在dna 聚合酶引导下的链延伸反应三个阶段的多次循环。每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板，理论上，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2n倍，在短时间内可在体外可获得数百万个特异靶dna序列的拷贝。pcr检测试剂越来越成为临床疾病的诊断治疗监测、预后评估的重要手段。pcr检测试剂生产企业也越来越多。但在实际检查中，笔者发现，各个企业pcr检测实验室设置各不相同，管理方式千差万别。

pcr检验实验室是pcr试剂的生产企业在产品检验过程中不可缺少的工作环境，其环境控制水平和质量管理水平直接影响着最终产品的质量。由于该产品本身的特殊性，《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》中，明确对pcr试剂的生产和检验环境做出了规定。《pcr检验实验室检查要点指南》旨在指导北京市医疗器械现场检查人员对pcr检验实验室的现场检查工作。同时，为pcr类体外诊断试剂生产企业在pcr检验实验室的设计和管理要求方面提供参考，将于年内正式发布。1 适用范围

本《指南》可作为北京市食品药品监督管理局组织、实施的《医疗器械生产许可证》核发、变更、换证等现场检查，体外诊断试剂生产实施细则检查，医疗器械生产监督检查等各项涉及pcr检验实验室检查的参考资料。基因测序检验实验室等涉及pcr实验的相关部分应参照本《指南》执行。2 检查要点及流程

2.1 现场观察企业pcr检验实验室布局 pcr检验实验室的设计决定了检验环境的优劣，企业应提供pcr实验室设计方案和/或平面设计图（应标明风向或压差梯度）。①为防止在检验过程中产生的气溶胶对生产过程的不利影响，按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，pcr检验实验室与pcr产品生产区域应在各自独立的建筑物中。②原则上pcr检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。根据使用仪器的功能。区域可适当合并。若使用实时荧光定量pcr仪且不需要进行后续产物分析工作，扩增区、扩增产物分析区可合并[1]。若使用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分 析区可合并。

③各区域在物理空间上应完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态。不应只是形式上的分区，不应一个区域嵌套一个区域。④各区域不应有空气的直接相通。扩增区与扩增产物分析区各区域宜采用独立直排方式出风。采用空调机组方式的，pcr实验室应具备独立空调机组；同时应考虑停机后各房间空气连通的可能性，采取必要的控制措施。

⑤按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力应以递减的方式进行，使得pcr检验实验室的空气流向应按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。空气流向应为单向，禁止下游污染上游。应设置合理的压差梯度，并安装压差监测装置，以有效证明空气流向，考虑到北京常年平均风力的情况，结 附图1 缓冲间为负压的理想pcr实验室设置模式 附图2 缓冲间为正压的理想pcr实验室设置模式

pcr检验实验室篇五

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的dna，就能用pcr加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易dna扩增法，意味着pcr技术的真正诞生。到如今2013年，pcr已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的taq dna聚合酶，为pcr技术发展也做出了基础性贡献。

pcr(聚合酶链式反应）是利用dna在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°c左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度（72°c左右），dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

荧光定量pcr技术检测的报告形式 一，拷贝数的意义：

表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量

二，拷贝数与病原体的关系：

拷贝数与病原体的数量成正相关

三，报告形式：1如果标本量是可以定量的，如血液等，则检测结果报告为：iu/ml(可溯源到国际标准物质的标准品)如hbv-dna：检测下限：100iu/毫升 即：<1.00e+02iu/ml 如果标本不能定量，如痰液，分泌物等，则结果只能报：copies/毎测试 荧光定量pcr 在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知的起始模板进行定量分析的方法。

ct值得意义

扩增越靠后定量的重复性就越差

--扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响，偏离线性--在ct值处重复性非常好--荧光定量技术要求在低浓度进行

荧光定量pcr在临床中的应用 一,感染性疾病 1，肝炎病毒定量检测

2，结核杆菌及呼吸道病原体检测 3，优生优育（torch）相关项目检测 4，性病病原体检测

5，手足口病相关病毒ev71，柯萨奇病毒的检测 二，肿瘤个体化诊断与治疗 三，遗传性疾病 四，疾病风险评估

乙型肝炎病毒（hepatitis b）

hbv基因分型与chb（临床遗传性疾病）的关系 全基因组测序hbv可分为a.b.c.d.e.f.g.h 8个基因型 hbv基因型--hbv基因型与病毒复制及病毒标志物表达的关系--hbv基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--hbv基因型与抗病毒疗效之间有关系

血清学指标（-）不能排除hbv感染 hbeag(-)/hbv-dna(+)编码e抗原的pre c区基因极易出现变异，在pre c区出现终止密码子，在pre c区基因与c区基因不能转译出完整的e抗原。导致hbeag表达缺失，机体感染hbv不表达hbeag，当然血清学方法也不能检测出hbeag的存在。

hbv基因型---hbv基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--hbv基因型是影响慢性乙型肝炎的临床转归的主要决定因素之一。

--hbv感染的临床转归一方面决定于患者的年龄和免疫能力，另一方面与基因型种类密切相关。在b,c为优势地区，c型具有较强的疾病能力，预后差；在以a,d为优势的地区，d型具有较强的致病性，肝病严重，预后不良；基因型c在乙肝后肝硬化的发病中起一定的作用，然而基因型b与年轻无肝硬化患者肝癌的发生有关。

hbv基因型与抗病毒疗效之间有关系

--干扰素抗病毒疗效与hbv基因型有一定的相关性，基因c和d对干扰素的治疗反应比基因型a和b要差

（hbv基因型与病毒复制与清除。病毒变异.临床表现.治疗应答和预后均有关系，提示不同基因型具有不的致病性）

hbv dna与疾病的诊断 hbv dna与乙肝”两对半“

---”两对半”：机体的免疫反应状态，为间接指标----hbv dna是乙肝病毒的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠，最直接的指标。

----“携带者”，“大三阳”，“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。

“大三阳”与hbv-dna：

“ hbsag（+）hbeag（+）hbcab（+）”提示患者体内hbv-dna呈活动性复制，传染性强，荧光定量pcr方法检测hbv-dna阳性检出率大于80-90%，且病毒载量>10的六次方iu/ml “小三阳”与hbv-dna：

“ hbsag（+）hbeab（+）hbcab（+）”，hbv-dna阳性率为40-80%左右，且病毒载量<10的六次方iu/ml。一般情况下

hbeab（+）表明hbv复制处于较低水平并可能和宿主dna发生整合，导致含量较低，应进行hbv-dna定量检测。

常规结核病实验室诊断方法及不足--细胞培养“金标准”,周期长

--痰涂片作抗酸染色：灵敏度差，检出率《30%。特异性差，无法将结核杆菌和其他分枝杆菌区分开--血清学诊断：交叉反应，假阳性

fq-pcr诊断结核的关键点

--痰液，肺及支气管灌洗液--肺结核--血液-播散性结核和各脏器的结核病--脑脊液-中枢神经系统结核病

--宫颈拭子，尿道拭子-泌尿生殖系统结核病--胸水-结核性胸膜炎--腹水-结核性腹膜炎

hcv的基因型/亚型 {6个型，68个亚型}-1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m-2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m-3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,-4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t-5a-6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n 中国亚型1b（66%），2a（14%），对抗病毒治疗应答不同，因此治疗方案不同。hcv的基因耐药突变

特异基因靶向治疗（小分子抑制物）中靶点编码区的耐药--hcv蛋白酶（ns3-4a）--rnv酶（ns5b）hcv的基因型与药物治疗--现知欧美国家多数hcv-1型感染，而亚洲国家以2型为主，三型次之

--三型感染临床症状较重，有引起严重肝病的倾向--1b型感染对干扰素治疗不敏感，效果差，2a型感染用干扰素治疗效果好。

hcv rna 定量的临床意义？？？？

torch感染特点

--母婴传播的主要病原体

--引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因--自然状态下呈隐性感染

--怀孕，多次输血，aids等易发生显性感染--可致多发性，全身性感染

--只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防 torch相关病原体检测-弓形虫（tox）-风疹病毒（rv）-人巨细胞病毒（hcmv）-单纯疱疹病毒（hsv-2）

基因检测与预测医学

基因检测使预测医学称为可能。疾病分险基因，易感基因的检测，不同人群差异基因的检测，可以全面评估个体对相关疾病的患病风险，从而预测疾病的发生，早期干预，预防。

结核杆菌与呼吸道病原体检测--结核杆菌（tb）--eb病毒（ebv）--肺炎衣原体（cp）--肺炎支原体（mp）常见性传播病原体检测-淋球菌（ngh）-沙眼衣原体（ct）-解脲支原体（uu）-梅毒螺旋体（tp）-单纯疱疹病毒（hsv）-乳头瘤病毒（hpv）-人类免疫缺陷病毒（hiv）